GFPおよびそのspectral variantであるCFP、YFPなどと種々のステロイドホルモンレセプター(本研究課題においては主としてグルココルチコイドレセプター(GR)、ミネラルコルチコイドレセプター(MR))あるいは核-細胞質間輸送蛋白のimportin αやimportin βとのキメラ遺伝子を作成した。これらをCV-1
COS-1細胞、初代海馬培養神経細胞、初代培養グリア細胞などにリポフェション法によりトランスフェクションし、レセプターや共役転写因子がリガンドの添加や細胞外環境の変化に対してどのような挙動を示すのかを、落射型蛍光顕微鏡と冷却CCDカメラの組合せまたは共焦点レーザー顕微鏡を用い、リアルタイムに追跡した。その結果、GRはリガンドの非存在下では主として細胞質に局在し、MRは細胞質と核の両者に分布することが認められ、リガンドの添加によりGRおよびMRともに速やかに核内へ移行することが、また核内移行に際して微小管などの関与は認められないことなどが明らかにされた。さらに、GRおよびMRを各々CFPおよびYFPで二重標識して同一細胞内に共発現させた実験において、核内移行速度は内因性のレセプターをもたないCOS細胞ではリガンドに対する親和性の差を反映していたが、内因性のGRおよびMRが共発現する海馬の神経細胞ではリガンドに対する親和性を反映した核移行速度の差は認められず、異なる核輸送の機構が存在する可能性が示唆された。また、hsp90の特異的阻害剤であるgeldanamycin投与によりCOS細胞においてGRおよびMRの核移行が阻害され、これらレセプターの核移行にhsp90が重要な役割を担っていることが示唆された。さらにGRやMRの核移行シグナル(NLS)を認識するimportin αをCOS細胞に発現させると、細胞質、核の療法に存在する細胞が多く認められたが、細胞質有意、核有意に存在するものも認めた。外からの刺激なしでも核内への移行が観察されたが、GRやMRと共発現させた場合は、リガンドの添加によって細胞質に存在するimportin αの核内への強い集積を認め、輸送蛋白が核内レセプターとともに動く像をリアルタイムに可視化し、捉えることができた。今後はFRETなどの手法を加えて、時空間特異的にこれらレセプターと輸送蛋白との相互作用を追跡していきたいと考えている。
